簡(jiǎn)述酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)ELISpot將細(xì)胞培養(yǎng)與免疫檢測(cè)原理相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平對(duì)細(xì)胞因子分泌頻率的直接定量分析。該技術(shù)能夠從數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)出單個(gè)分泌目標(biāo)因子的細(xì)胞在疫苗免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)、感染性疾病監(jiān)測(cè)及腫瘤免疫研究中具有不可替代的價(jià)值。一、ELISpot的技術(shù)原理與工作流程一細(xì)胞因子原位捕獲ELISpot實(shí)驗(yàn)在預(yù)包被了特異性捕獲抗體的PVDF微孔板中進(jìn)行。將待測(cè)細(xì)胞如外周血單核細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與特定刺激物抗原肽段、絲裂原等共孵育后活化的細(xì)胞在局部環(huán)境中分泌細(xì)胞因子這些因子隨即被孔底緊鄰的捕獲抗體立即結(jié)合。二免疫酶學(xué)放大與斑點(diǎn)形成洗去細(xì)胞后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體針對(duì)不同表位的二抗形成捕獲抗體-細(xì)胞因子-檢測(cè)抗體夾心復(fù)合物。隨后加入酶標(biāo)記的親和素如堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素在底物如BCIP/NBT作用下酶催化反應(yīng)在抗體結(jié)合位點(diǎn)附近形成不溶性紫色沉淀最終產(chǎn)生一個(gè)清晰可辨的斑點(diǎn)。三結(jié)果判讀與定量每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌該細(xì)胞因子的細(xì)胞。通過(guò)人工計(jì)數(shù)或自動(dòng)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)可獲得每孔中陽(yáng)性斑點(diǎn)的總數(shù)從而計(jì)算出分泌目標(biāo)細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率如每百萬(wàn)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。二、ELISpot相比ELISA的核心優(yōu)勢(shì)一功能層面的本質(zhì)不同ELISA通過(guò)顯色反應(yīng)測(cè)定上清液中積累的可溶性蛋白總量反映的是分泌了多少而ELISpot直接可視化單個(gè)細(xì)胞分泌行為回答的是有多少細(xì)胞在分泌。這一區(qū)別在疫苗免疫應(yīng)答監(jiān)測(cè)中尤為重要——關(guān)鍵指標(biāo)是抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量而非每個(gè)細(xì)胞分泌的絕對(duì)量。二單細(xì)胞水平的超高靈敏度ELISpot能從20萬(wàn)至30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌特定細(xì)胞因子的細(xì)胞這一靈敏度遠(yuǎn)高于ELISA檢測(cè)下限通常在皮摩爾級(jí)。常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子需細(xì)胞活化數(shù)小時(shí)并可能因細(xì)胞通透處理丟失信號(hào)ELISpot實(shí)時(shí)捕獲分泌的細(xì)胞因子更真實(shí)反映細(xì)胞功能。三動(dòng)態(tài)功能信息的高效獲取與僅提供轉(zhuǎn)錄本豐度的RNA檢測(cè)技術(shù)不同ELISpot直接測(cè)量蛋白質(zhì)水平的細(xì)胞效應(yīng)功能且以單細(xì)胞頻率為計(jì)量單位為評(píng)估疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫提供了量化指標(biāo)。三、ELISpot的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)一捕獲抗體的選擇與預(yù)包被高質(zhì)量、高親和力、低內(nèi)毒素的捕獲抗體是確保特異性和低背景的基礎(chǔ)。預(yù)包被需均勻且充分避免邊緣效應(yīng)。二細(xì)胞數(shù)量的優(yōu)化與刺激條件細(xì)胞接種密度的確定需保證孔底單層分布。刺激物抗原肽、多克隆刺激劑或特異性抗原的濃度、孵育時(shí)間和溫度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞類型進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。三斑點(diǎn)顯色的控制與背景管理顯色反應(yīng)需精確掌控時(shí)長(zhǎng)過(guò)度顯色會(huì)導(dǎo)致背景升高或斑點(diǎn)融合。設(shè)陰性對(duì)照無(wú)刺激物和陽(yáng)性對(duì)照多克隆刺激劑是監(jiān)控實(shí)驗(yàn)條件的基本要求。四、ELISpot的典型應(yīng)用場(chǎng)景一疫苗免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)在艾滋病疫苗、乙肝疫苗、腫瘤疫苗等研發(fā)中ELISpot被廣泛用于檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞頻率是評(píng)估疫苗免疫原性的核心指標(biāo)之一。二感染性疾病研究ELISpot可用于結(jié)核感染診斷T-SPOT.TB技術(shù)即基于ELISpot原理通過(guò)檢測(cè)結(jié)核特異性抗原刺激下釋放IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量輔助診斷潛伏性結(jié)核感染。此外在病毒性肝炎、HIV感染等研究中ELISpot也被用于監(jiān)測(cè)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的動(dòng)態(tài)變化。三腫瘤免疫與細(xì)胞治療在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞研究和CAR-T細(xì)胞治療中ELISpot用于評(píng)估效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的特異性反應(yīng)強(qiáng)度。雙色或FluoroSpot技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)同一細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-2提供更豐富的功能表型信息。